In-Cell Western 免疫荧光定量分析信号转导

In-Cell Western 免疫荧光定量分析信号转导

In-Cell Western（ICW）是一种用于定量检测细胞内蛋白表达量或信号传导的方法，既简单又经济高效。ICW检测方法将细胞接种在微孔板中，然后进行固定/通透化，利用特异性一抗，红外染料偶联的二抗体进行标记。通过Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱激光成像系统获取荧光信号，可以精确测量细胞信号通路的诱导或抑制，并能够在单个孔板上进行多种处理和多次重复。 

ICW技术中免疫荧光检测

在生命科学研究领域，尤其是信号转导和磷酸化蛋白的分析中，蛋白表达水平的量化越来越重要。这些研究中通常需要分析许多样品，密切的检查信号转导事件的事件，并评估各种实验条件。In-Cell Western（ICW）定量免疫荧光测定法，简化的实验流程，可以并行处理并检测多个试验样品，高通量进行实验程序和数据分析。微孔板检测将Western Blot的特异性与ELISA的重现性、高通量相结合，能够有效的定量多个样品中相对蛋白水平和信号转导事件。In-Cell Western技术也被称为cytoblots（细胞印迹），细胞ELISA（cLISA），细胞内ELISA（ICE）或FACE（基于快速激活的细胞ELISA）。

图1. ICW技术示意图。在96孔板或384孔板中培养细胞，并进行固定和通透处理，再通过IRDye偶联的二抗，通过免疫荧光检测靶蛋白的荧光信号，对微孔板进行成像并量化信号强度。

     ICW技术基于标准的免疫荧光技术，二抗中标记了近红外荧光染料，两种NIR荧光染料能够被检测器检测，提供双通道检测信号，使用Sapphire™双模式多光谱激光成像系统（Azure Biosystems）对每个孔中细胞群体的荧光信号成像，得到检测结果。ICW使用近红外的原因是，在近红外波长范围中，塑料，细胞，化学试剂的自发荧光背景很低，背景值远低于可见光波长范围。因此定量Western检测中，非常适合使用近红外波长进行检测。

ICW检测可以使用3种荧光通道进行检测，一种可见光荧光通道可用于针对细胞染色或总蛋白染色进行归一化（normalize），以通过校正孔与孔之间细胞数的差异来提高准确性。被研究的两种靶蛋白使用2个近红外荧光通道进行检测，类似于近红外荧光Western Blot，可以同时检测两种目的蛋白。对于磷酸化蛋白分析，一个红外通道检测靶蛋白，另一个红外通道检测磷酸化靶蛋白。

图2：ERK的磷酸化对信号通路刺激的响应。 用EGF刺激A431细胞。 （a）用磷酸-ERK抗体（绿色； 800nm）检测到ERK磷酸化。 还检测到每个孔中的ERK总水平（红色； 700 nm）。 重叠图像中的黄色表示700和800 nm信号重叠。 在96孔板的一部分中显示了两排孔。 （b）荧光定量。 将磷酸ERK信号相对于总ERK信号进行归一化，以校正细胞数之间的差异。 与静止状态相比，EGF刺激的细胞显示ERK磷酸化增加> 16倍。

转载自：Analytical Biochemistry 338：136–142.

Western Blot的替代方法

ICW检测可以作为Western Blot（WB）的替代方法。在ICW检测中，数百种样品能够被快速检测，靶蛋白在固定的细胞中进行原位检测，输出高精度、量化数据结果。而在WB检测中，蛋白经历了细胞裂解，电泳和膜转移步骤，这些步骤费时费事，而且引入很多变量降低了检测精度。在微孔板中，少量固定剂就能够终止细胞活动，保存细胞内容物。ICW能够均匀、精确的终止实验反应；随着时间的推移，动态分析细胞信号转导事件，并且实验重复性更好。由于实验过程中引入的变量减少，ICW分析的标准差低于Western印迹（图3；WB分析的CV = 0.27； ICW分析的CV = 0.08-0.16）。 WB的变异性和误差增加可能会掩盖蛋白质表达水平的统计学显著变化，而这些蛋白质表达水平的统计学变化能被ICW捕捉到。

图3. WB和ICW分析中的变异性比较。 用催产素刺激子宫肌细胞的原代培养。 然后使用WB和ICW分析，在重复样品中检测GAPDH和PMLC 20的水平。 （a）将两个相同的蛋白质印迹的条带强度绘制为两个印迹中每个印迹的13个样品的平均值的比例（印迹1为蓝色；印迹2为红色）。 CV为0.27。 （b）来自两个ICW板的重复孔的信号强度，以两个板中每个板的平均值的比例绘制（板1为蓝色；板2为红色）。 CV范围为0.08至0.16。

转载自： PLoS One 5(4):e9965

ICW检测结果中的信号增减与WB相似，IC50值也相似，但是标准差更小。在评估EGF受体抑制剂的实验中，ICW检测得到的IC50数值与发表文献一致。384孔的ICW功能测定，用于监测多巴胺D2和D2 G蛋白偶联受体（GPCR）的药理作用。 GPCR激动剂诱导ERK磷酸化，pERK作为细胞内生化标记物，用于评估多巴胺D2和D3受体激动剂和拮抗剂。 这种非放射性测定的结果与其他功能测定相当。 由于ERK是一种内源性报告蛋白，因此无需进行细胞修饰即可导入嵌合G蛋白或报告基因。  另一项GPCR激活研究直接将ICW检测技术与公认的cAMP结合和积累分析技术进行了比较。 CREB磷酸化作为内源性A 2A受体激活的标志，其结果与放射性配体结合研究和cAMP免疫分析的结果密切相关。

ICW检测的应用

图4. 用Wnt3a刺激细胞后，β-连环蛋白积聚的动力学。 （a）用ICW测定法评估细胞β-连环蛋白的时间和剂量依赖性积累。 将L细胞与Wnt3a孵育，然后对β-catenin（合并图像中的黄色）和DNA含量（红色）染色。 （b）定量β-连环蛋白的积累。 在Wnt3a刺激的30分钟内，该水平被上调，在6至8小时之间显示出增加的强度，并在10小时后开始达到平稳状态。 图显示了两个独立的实验，每个实验一式四份。

转载自：PLoS One 3(10):e3498

ICW检测提供了一种整体测量的“快照”式结果，在细胞固定的那一刻，进行信号转导和蛋白表达状态的检测。对于贴壁细胞研究，ICW分析是流式细胞术的一种便捷替代方法，对于不需要高含量筛选（high  content  screening ：HCS）的研究，提供了一种低成本的替代方案。ICW检测适用于监视蛋白质水平和磷酸化状态，但不能微观分析单个细胞的特征，例如蛋白质易位或细胞形状。 ICW分析已用于分析：1. 蛋白质的磷酸化和信号传导，2. 药物对信号通路的脱靶作用，3. 信号事件的时机和动力学（ 图4），4. 病毒载量的定量分析，5. 遗传毒性测定和细胞增殖测定，6. 幽门螺杆菌诱导的上皮信号转导原位分析，7. 糖蛋白分析，8. 文库筛选和9.单克隆抗体克隆的筛选。

使用Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱激光成像系统进行ICW实验

材料和方法

培养细胞

连续稀释HeLa细胞，并以每孔0.2 mL的体积接种到96孔无菌组织培养板中，并生长至约80％汇合。 固定所有孔，并在室温下使用100％甲醇渗透15分钟。

In-cell Western（ICW）实验

固定和透化后，将细胞在PBS中冲洗，在室温下用PBS中的1％鱼明胶封闭1小时，然后在4°C下过夜孵育α-微管蛋白和β-肌动蛋白一抗。 用PBS洗涤样品3次，再与AzureSpectra 550和AzureSpectra 800偶联的二抗孵育60分钟。

二抗体与RedDot™1核染色一起孵育，以使总细胞数归一化。板块在成像前，用PBS洗涤样品3次。

成像

洗涤后，使用板焦点设置选项，在Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱激光成像系统上对微孔板进行成像。

结果与结论

在本实例中，我们展示了使用Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱激光成像系统，原位定量细胞内蛋白质的能力。 HeLa细胞在96孔板中生长，先用α-微管蛋白和β-肌动蛋白抗体检测，然后用分别与AzureSpectra 550和AzureSpectra 800偶联的同种型合适的二抗进行探测。 将所有孔与RedDot™1核染色液一起温育以标准化总细胞数。 图像使用Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱激光成像系统采集，显示在图6中。所示的代表性图像证明了Sapphire™双模式多光谱激光成像系统可以实现的高灵敏度和特异性的信号采集。

在96孔板上进行细胞ICW分析可准确测定细胞内蛋白质的原位表达； 并提供了一种高通量方法，可评估多种刺激，多个终点，目的蛋白的表达水平，并能在单个孔板上重复实验结果。 通过使用NIR抗体和Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱激光成像系统，还可以进行多重分析，从而进一步提高了通量。

图5.  将连续稀释的HeLa细胞播种到96孔板中，培养，固定和透化。A）列1-3使用AzureSpectra 550（绿色）染料检测β-肌动蛋白。B）第3-6列用AzureSpectra 800（蓝色）染料检测α-微管蛋白。C）整个板块用RedDot1核染色作为归一化对照（红色）。D）各个通道同时扫描，然后用Sapphire Capture软件合并成一个单一的复合图像。

Sapphire双模式多光谱激光成像系统是新一代的激光扫描成像系统，提供无与伦比的灵敏度、超高的分辨率、更宽的动态范围、提供更高质量数据。

● 唯一使用扫描式和CCD检测双模式的分子成像系统

● 唯一使用PMT，APDs和CCD三种检测器进行信号采集的系统

● 分辨率可达10μm，分辨更细节

● 动态范围可达6logs，定量更准确

● 软件界面友好，易于使用